Bacillus subtilis növekedés-gátlási teszt talajra, agardiffúziós módszerrel

A teszt típusa: egy fajt alkalmazó, laboratóriumi bakteriális akut toxicitási teszt.

BME ABÉT "Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia" kutatócsoportja fejlesztette ki a módszert fémszennyezettség felmérésére. A tesztorganizmus, a Bacillus subtilis toxikus fémekre mérsékelten érzékeny talajbaktérium.

 A módszer elve: A környezeti mintából (talaj) agarral szilárdított mintakorongot készítünk, és ezt helyezzük a tesztorganizmust tartalmazó tápagar felületére. A szennyezőanyag a mintakorongból az agarlemezbe diffundál és mennyisége, valamint  toxicitása függvényében gátolja az agaros táptalajban egyenletesen eloszlatott és lemezként kiöntött Bacillus subtilis szaporodását. A mintakorong körül kialakult, kisebb denzitású, un. kioltási zóna mutatja a gátlást.

Az agardiffúzós teszt kivitelezése: A Bacillus subtilis törzset 24 órán át, 28 ^oC-on, rázatás közben szaporítjuk 20 ml húslé tápoldatban (inokulum). A kísérleteket 30x30 cm-es steril üvegtálcában végezzük, melybe 100 ml 50 ^oC-os húslé agarhoz kevert 20 ml inokulumot öntünk. Az egyenletes tápagar vastagság érdekében vigyázni kell, hogy a tápagar megszilárdulása teljesen vízszintes felületen történjen. Az agar megszilárdulása után helyezzük a mintakorongokat a tápagar felületére.

Az érzékenységi vizsgálatokhoz a mintakorong készítése a következők szerint történik: 3,5 cm átmérőjű edénykébe 0,2 ml standard oldatot és 2 ml megolvasztott vizes agar keverékét öntünk, majd megszilárdulás után 13 mm átmérőjű dugófúróval vágjuk ki a mintakorongot. Talajminták esetén 2 ml megolvasztott vizes agar-agarhoz 1 g talajt keverünk, megszilárdulás után hasonlóan járunk el, mint a standard oldatok készítése esetén. Az elkészített mintakorongokat az agar megszilárdulása után a tápagar felületére helyezzük. A mintakorongokat hordozó agarlemezeket 30 ^oC-on inkubáljuk, 24 óra elteltével értékeljük a kísérleteket.

Az értékeléskor a mintakorong körül kialakult zónát méretével és jellegével (gátlási, serkentési) jellemezzük. Gyengítési zóna gyakran több gyűrűre osztható, értékeléshez mindig a legkülső gyűrű átmérőjét használjuk.

Standard oldatsor esetén a kioltási zóna átmérője arányos a szennyezőanyag koncentrációjával, így a zóna átmérőjéből következtethetünk a szennyezőanyag mennyiségére.

Talajminták esetén vegyi anyagok keverékével állunk szemben, amelyek agarban jellemző viselkedését a talajalkotók is jelentősen befolyásolják. A szennyezőanyagok legkülönbözőbb kémiai formáinak oldhatósága és diffúziója eltérő. Ezért szilárd fázisú minták esetén a kioltási zóna átmérője és a minta toxicitása közötti viszony nem mindig kvantitatív, viszont jól mutatja az aktuális toxicitást.

Szennyezett területek felmérése során elővizsgálatra, a negatív minták kiszűrésére javasolt, gyors ökotoxikológia teszt.