Brachiodanio rerio

Tesztorganizmus neve

Latin név

Brachiodanio rerio

Magyar név

zebrahal

Angol név

zebrafish

Rendszertani besorolás

-          ország

Állatok - Animalia

-          törzs

Gerinchúrosok - Chordata

-          osztály

Sugarasúszójú halak - Actinopterygii

-          rend

Pontyalakúak - Cypriniformes

-          család

Pontyfélék - Cyprinidae

-          nemzetség/nem

Danio

-          faj

Danio rerio   [1]

Tesztorganizmus jellemzői 

Élőhely

India, Burma, Maláj-félsziget, Szumátra, de mára közkedvelt akváriumi hal, háziasított halfaj lett [2,3]

Fontosabb külső jegyek

Körülbelül 6 centiméter nagyságúra nő meg és megközelítőleg 5 évig él. Különböző színezetű és úszóformájú fajták ismertek. A hímek karcsú, narancssárga színű csíkokat hordanak kék csíkjaik között, a nőstényeknél ugyanott ezüstszínű csíkok figyelhetőek meg, teltebb, színei kevésbé élénkek. Háta olajbarna, az oldalak és a has alapszíne sárgásfehér. Törzsén a kopoltyúfedőtől a farkúszó végéig négy sötét acélkék csík húzódik. A csíkozottság a farok alatti úszóra is átterjed. A hátúszó alapszíne sárgásbarna, kék szegéllyel, kívül fehéren szegélyezett. A kopoltyúfedő kék fehér foltokkal. Farok- és hasúszói fátyolszerűen megnyúlhatnak, melyek akár a testhossz egyharmadát is kitehetik. [2,3]

Táplálkozás

mindenevő [2,3]

Szaporodás

Ikrával, a párzás során a nőstény 20-200 ikrát helyeznek el (általában hetente egyszer, de bőséges táplálék mellett kéthetente háromszor párzanak). Ikrák 24-28 óra alatt kelnek ki, az apró halak pedig 4-5 nap múlva úsznak el, nagyon aprók. [2,3]

Egyéb fontosabb jellemzők

Szabványok és referenciák

Szabványosított tesztmódszer

Szabvány típusa, száma

MSZ: 22902-3:1990

MSZ: 21978-3:1986

ISO 7346-1-2-3:1996

ISO 10229:1994

ISO 15088:2007

ISO 12890:0999

OECD: No.203-204, 210, 215, 219, 220, 229, 230

ASTM E1711-95 (2008), E729-96(2007), E1022-94 (2007), E1192-97(2008) [7,8,9]

Nem szabványos tesztmódszerek

például in situ monitoring céljára élővízekbe helyezett halketrecben

Környezettoxikológiai alkalmazás: Mind vegyi anyagok toxicitásának mérésére, mind környzeti vízminták és szennyvízek tesztelésére  alkalmazzák.

Tesztorganizmus fenntartása

A speciális zebradánió tartására kifejlesztett haltartó rendszerben, vagy egyszerűen akváriumban.

Általában 5-7 halat helyeznek koncentrációnként a tesztoldatokba (1ghal/l).

Általános elhelyezés: 6-25 állat/40-50 l-es akváriumba (csoportosan szeretnek élni).

Az optimális vízhőmérséklet: 18-26°Cközött (31°C-on már szaporodási zavarok léphetnek fel). Az ideális a 6.00-8.00 közötti pH, és az 5.0-19.0 dGH közötti vízkeménység.

Életterek:

• rendszer vagy  tankvíz: felnőtt állatok
• embrió-médium: 10%-os Hank féle oldat a vízhez adagolva
• ívási víz: sókeverékek megtermékenyüléshez

Fenntartáshoz táplálás: mindenevők, ezért húst, májat, ikrát, rákot, algát is lehet adni nekik, illetve ásványi anyagot, és vitaminokat is lehet.

A megvilágítás általában 16 órás legyen, azt 15-30 perc átmenettel 8 órás sötét fázis kövesse. [4,5]

Teszteléshez használt organizmus jellemzői

A halfajok közül a legelterjedtebben alkalmazott. Megfelelő érzékenységgel használható vegyi anyagok széles skálájának kockázatbecslése során. Könnyen kivitelezhetők a fajon embrionális vizsgálatok, mivel a nagyszámú, kisméretű ikrát produkálnak, így lehetőség nyílik kis mennyiségű minták vizsgálatára. Az ikrák áttetszőek, így a szervek fejlődése könnyen megfigyelhető, kísérhető az első 48 órában. A szubletális végpontok széles skálája alkalmazható a tesztek során, mint pl. fejlődéstani, biomarker változások. Megfelelő korreláció figyelhető meg a korai fejlődési stádium és a felnőtt egyedek között.

A szaporítási és felnevelési technológiájuk egyszerű.

A tesztállatok korban és méretben azonosnak kell lenniük. A leghosszabb hal mérete ne legyen nagyobb, mint a legrövidebb kétszerese.

Az ívatáshoz elegendő 8-10 l-es akvárium is. Ilyenkor a vízoszlop magassága ne legyen több 15 cm-nél. A víz keménysége, pH-ja nem befolyásolja az ívatás sikerességét. A felhasznált víz friss legyen. A medence alját kavicsokkal fel kell tölteni az ikrák védelmében, vagy ikravédő rácsot kell felhelyezni, mert a daniók erősen ikrafalók.

A kísérleteket kb 4.5 cm-es kifejlett, felnőtt állatokkal, és embriókkal is lehet végezni.

Az ivarérettséget már a 3. hónapban elérik. Hasznos élettartamuk pedig 1.5-2 év. A nőstények kb.20-200 ikrát raknak le hetente. Az embriók az anya testén kívül fejlődnek. Embriogenezisük ex utero nyomon követhető. Kifejezett  ivari dimorfizmus jellemző rájuk.

Békés állatoknak tekinthetők. Tartásuk könnyű, mert nem túl érzékenyek. A halak az egyetlen kizárólag vízben élő gerinces állatok. (idegrendszer fejlettsége, ezért is végeznek velük annyi tesztet)

Az ökotoxikológiai teszteken kívül még végeznek velük pl. genetikai (gerincesekre vonatkozó törvényszerűségek vizsgálata), környezetkutatásos, humángenetikai, fejlődésgenetikai vizsgálatokat is. [5,6,8]

Tesztorganizmus érzékenysége

Érzékenyek lehetnek a csapvíz O₂ és Cl tartalmára. Emrió-médium korban a lárvák ikerhéjból való kibújásához Ca szükséges. A megtermékenyüléshez pedig sókeverékek (pl. NaCl, KCl, CaC) kellhetnek.

A táplálás során figyelni kell a mennyiségre, kb. 5 perc alatt elfogyasztott mennyiséget adjunk nekik, mert felléphet vírus és parazita fertőzés veszélye.

Beltenyésztésre alig érzékenyek.

Összességében nem mondhatók érzékeny fajnak. [5,6,8]

Tesztmódszer alkalmassága

Legtöbbször vízi ökoszisztémák érzékenysége, vízi ökoszisztémát veszélyeztető vegyi anyagok hatásának vizsgálatára használják őket (felszíni víz, fürdővíz, szennyvíz). De veszélyes hulladékok hatásait, üledék vizsgálatára is alkalmasak.

• pl. adult halakon végzett akut tesztek
• hal embriókon végzett akut tesztek
• teljes életciklus tesztek

viselkedési vizsgálatok [5,6,8]

Tesztelés elve

Végrehajtható határérték-vizsgálat 100 mg/liter koncentrációban annak bemutatására, hogy az LC50 nagyobb, mint e koncentráció. A halakat a vízhez adott vizsgált anyag hatásának kell kitenni, koncentrációk egész tartományában, 96 órás időtartamon át. A pusztulást legalább 24 órás időközönként fel kell jegyezni, és ahol lehetséges, ki kell számítani az egyes megfigyelési időpontokban a halak 50 %-át elpusztító koncentrációkat (LC50). [5,6,8]

Tesztmódszer leírása

Adult halakon végzett akut teszt:

OECD 203-as irányelv, illetve a MSZ EN ISO 7346-1, és MSZ 22902-3 szabványok szerint. Statikus tesztet 96 h-án át, LC50, illetve Dil. TL_m meghatározásra.

Teszt beállítása: ismeretlen hatású anyag tesztelésekor az előteszt során meghatározzák a közelítő LC50 értéket. A tesztek során a hígítási sor mértani sorát ki kell alakítani. 7 halat helyeznek konventrációnként a tesztoldatba (1g hal/l). Előnevelt, 4-6 hetes, 2±1 cm-es egyedeket használnak fel. A tesztek kezdetétől 4, 34, 48, 72, 96 órával mérik meg a vízkémiai paramétereket. Tapasztalatok: vízminták tesztelésekor, a minta vétel után 24 órával meg kell kezdeni a tesztet, probléma lehet a minta hőmérséklete. A zebradánió esetén a protokolokban meghatározott ASV 50% körüli érték sem okoz problémát a halaknak. Hígító vízként a halak tartására használt rendszervizet használnak. A fél statikus tesztek során munkaszervezési problémát vethet fel az akváriumok 24, 48 óránkénti oldatcseréje.

A mérgező hatásra a halak állapotából, elpusztult egyedek számából következtethetünk. Halottnak akkor tekinthető egy egyed, ha a faroknyelükhöz érve már nem mutatnak reakciót. Az értékeléskor minden egyes ajánlott expozíciós időtartam vonatkozásában az elhullások kumullált értékét vesszük figyelembe.[8,9]

Mérési végpontok

pusztulás, letalitás, mozgásképtelenség, szaporodásbiológiai paraméterekben bekövetkezett változások detektálása nőstényeknél, leadott ikra mennyiségének vizsgálatával, motoros funkciókban bekövetkezett károsodások vizsgálata [5,6]

Vizsgálati végpontok

Leggyakoribb végpontok: letalitás, növekedés, mozgás, bioakkumuláció, reprotoxicitás különféle végpontjai.

1. K-dikromátra a felnőtt egyedek 112.76±26.66 mg/l, korai stádiumú 362.42±108.6 mg/l LC50 (96h) értékkel reagálnak
2. Theotoxis vizsgálat során 0.5 és 5 μg/l mikrocisztin koncentráció szignifikáns viselkedési változást okozott, 5 μg/l felett jelentősen csökkent a szaporodási aktivitás is.
3. Embrionális fejlődés kapcsán, hasonló mikrocisztin-LR koncentráció (5-50 μg/l) a kezelés során nem okozot könnyen megfigyehető változást. A kezelt embriókat toxinmentes környezetbe áthelyezve jelentősen csökkent az embrió fejlődési üteme és túlélési aránya. [8]

Tesztvégpontok: végpontok felsorolva: LC₅₀, LC₁₀, LD50, Dil. Tl_m, hpf, LT₅₀

Az egyes mérésekhez szükséges műszerek

szövettenyésztő lemez, akvárium, automatikus hígító rendszer (átfolyásos vizsgálatnál), oxigénmérő, vízkeménység meghatározására szolgáló berendezés, hőmérsékletszabályozó berendezés, pH mérő,

Tesztek időigénye

Akut tesztek általában min. 96 h

Egyéb 

Megjegyzések

A hal a legelterjedtebb vízi tesztorganizmus, a halak közül is a zebrahal az egyik legnépszerűbb. Mind szakirodalma, mind az eredmények hatalmas mennyiséget tesznek ki. Éppen ezért egyre gyakrabban találkozunk QSAR egyenletekkel, melyek a korábbi publikált mérési eredmények (toxicitás) és a vegyi anyag kémiai szerkezete közötti összefüggést mutatják meg. Egy ilyen egyenlet ismeretében nem kell egy új anyagot tesztelni, hanem a matematikai modell segítségével is megkaphatjuk a haltoxicitási eredményt.

Az állatvédők a halakat is védik tehát a teszteléshez felhasznált egyedek számának csökkentését követelik. Emiatt újfajta, a tesztelendő halszámot optimáló statisztikai  módszereket, lépcsőzetes tesztelést, kémiai és biokémiaia modellek, halpetével végzett tesztek kezdenek terjedni.