Lemna minor szaporodásgátlási teszt (levélkeszám és klorofill-tartalom alapján) vízmintákhoz (felszíni és felszín alatti víz, csurgalék víz és szennyvíz)

A békalencsék a víz felszínén úszó egyszikű, lágyszárú vízinövények. Nagyon elterjedt, gyorsan szaporodó évelők. Méretük 2–12 mm lehet. Virágaik egyivarúak. Ritkán virágoznak, általában testük sarjadzásával szaporodnak. A békalencsék szaporodási sebessége eltérő, a Lemna nemzetség duplázódási ideje laboratóriumi körülmények között 0,35–2,8 nap. Az apró békalencse tömeges megjelenése eutrofizációt jelez.

A szaporodás gátlási teszt során a békalencsék levélke számának változását nyomon követve illetve az extrahált klorofill-tartalom alapján következtethetünk a minták toxikus hatására.

A teszt kivitelezése:

Tápoldat:

Mikroelem oldat:                                                       Fe-EDTA oldat:

H₃BO₃                        2,86 g/l                                   FeCl₃·6H₂O                0,121g/250ml

MnCl₂·4H₂O               1,82 g/l                                   EDTA                         0,375g/250ml

ZnSO₄·7H₂O              0,22 g/l                                  

Na₂MoO₄·2H₂O         0,09 g/l                                  

CuSO₄·5H₂O              0,09 g/l                                  

Békalencse (Hoagland féle) tápoldat (Missouri Botanical Garden):

1 liter steril desztillált vízhez az autoklávozott oldatokból a megfelelő mennyiséget bemérjük, majd az alapos összerázás után beállítjuk a pH értéket 5,8-ra steril NaOH oldattal. A tápoldat elkészítése során a következő mennyiségeket mérjük be:

MgSO₄·7H₂O (24,6 g/100ml)                                    1,0 ml/l

Ca(NO₃)₂·4H₂O (23,6 g/100ml)                    2,3 ml/l

KH₂PO₄ (13,6 g/100ml)                                0,5 ml/l

KNO₃ (10,1 g/100ml)                                    2,5 ml/l

Mikroelem oldat                                            0,5 ml/l

Fe-EDTA oldat                                             20,0 ml/l

A vizsgálat menete:

A mérés két részből áll: Az első hét nap során a mintákban lévő békalencsék szaporodásának mértékét követjük nyomon levélkeszámuk alapján. A hetedik napon a mintákban lévő békalencséknek meghatározzuk az összklorofill tartalmát.

A tesztet 150 ml-es főzőpoharakban indítjuk. Minden szennyezett mintából három párhuzamost készítünk. Kontrollként tápoldatot használunk. A folyadékmintákból 50–50 ml-t mérünk be a főzőpoharakba, tetejükre 10–10 darab kétlevelű, sérülésmentes zöld színű békalencsét helyezünk. A főzőpoharakra fóliát helyezünk, hogy ne párolódjon, illetve szennyeződjön be a minta a teszt ideje alatt.

Az összeállított kísérleti rendszereket 21,5±1°C-os termosztátba helyezzük a 7 napos inkubálási időre megvilágítás mellett (8:16 órás sötét:világos ciklus, Daylite fénycső). A tesztelési idő alatt 24 óránként megszámoljuk a békalencsék leveleinek számát.

A 7. napon indítjuk a vizsgált minták összklorofill tartalmának mérését. Először mindegyik főzőpohárból kivesszük az adott mintákban lévő békalencséket és szűrőpapíron súlyállandóságig szárítjuk őket. Ezután csiszolatos, kupakkal rendelkező kémcsövekbe tesszük az adott mintához tartozó megszárított békalencséket és 5 ml 96%-os etanolt mérünk rájuk. Ezt követően 24 órán át, szobahőmérsékleten, sötét szobában állni hagyjuk őket.

Egy nap elteltével megmérjük minden minta optikai denzitását Sanyo SP55 UV/VIS spektrofotométerrel 3 különböző hullámhosszon (480, 647, 664 nm).

A mérés kiértékelése

A kiértékelését a levélkeszám és az összklorofill tartalom meghatározásával végezzük.

Kiszámítjuk az átlagos szaporodási sebességet (μ_i-j) a kontroll minta és minden minta esetében az alábbi képlet segítségével:

 μ_i-j = (ln(N_j)-ln(N_i))/(t_j-t_i)

Ahol,  – μ_i-j átlagos szaporodási sebesség az i-dik és a j-dik időpont között

μ_i – levélszám az i-dik időpontban

μ_j – levélszám a j-dik időpontban

t_i – i-dik időpont

t_j – j-dik időpont

Majd kiszámoljuk a szaporodás-gátlási százalékot (I_r) minden minta esetében

 I_r= 100*(μ_C-μ_T)/μ_C

Ahol,  I_r– szaporodás-gátlási százalék (%)

μ_C – a kontroll mintában lévő békalencse átlagos szaporodási sebessége

μ_T – a vizsgált mintában lévő békalencse átlagos szaporodási sebessége

A vizsgált minták összklorofill tartalmának (C_a+b) meghatározását a következő képlet alapján végezzük:

 C_a+b = (5,24*A664+22,24*A647)*V

Ahol,   C_a+b: mérendő minta összklorofill tartalma (μg összklorofill/ minta)

A₆₆₄: 664 nm hullámhosszhoz tartozó abszorbancia értéke

A₆₄₇: 647 nm hullámhosszhoz tartozó abszorbancia érték

 V: az extrakció során használt etanol térfogata (5 ml)

A teszt eredményeinek elfogadásához a következő feltételnek kell teljesülnie: A kontroll oldatban lévő növények átlagos duplázódási ideje (T_D) nem haladhatja meg a 2,5 napot, ami a következő képlet segítségével számolható ki:

T_D=ln2/μ_i-j

T_D – duplázódási idő

μ_i-j – átlagos szaporodási sebesség azi-dik és a j-dik időpont között