Dehidrogenáz enzimaktivitás mérése

Szerző: 
Nagy Zsuzsanna

A szerves anyagok aerob mikrobiális lebontása egy membránhoz kötött elektrontranszfer láncon keresztül történik, ahol az oxigén a végső elektronakceptor. Eközben ATP szintetizálódik, ezt nevezzük oxidatív foszforilációnak. A légzési lánc valamelyik enzimének aktivitását megmérve információhoz juthatunk a sejt energiatermeléséről, teljes oxidatív aktivitásáról. Ez a felismerés vezetett a dehidrogenáz enzimaktivitás méréséhez (Alef, 1995).

A dehidrogenáz enzimaktivitás méréshez trifenil-tetrazólium-klorid (TTC) mesterséges elektronakceptort használnak (Alef, 1995). A TTC vízben oldódik, redoxpotenciálja -0,08V. A dehidrogenáz, más egyéb enzimekhez hasonlóan a TTC-t trifenil-formazánná (TPF) redukálja. Szinte valamennyi mikroorganizmus képes erre a redukcióra, és a reakció mértéke kolorimetriásan meghatározható.

Szükséges anyagok:

1. Tris-HCl puffer: 12,1 g Tris (hidroximetil)-aminometánt feloldunk 700 ml desztillált vízben, majd sósavval beállítjuk a pH-t 7,6-ra és kiegészítjük 1000 ml-re.

2. TTC oldat: 80 ml Tris-HCl pufferben feloldunk 1,5 g TTC-t, majd kiegészítjük 100 ml-re ugyanazzal a pufferrel.

3. TPF standard sor: 50 mg TPF-t feloldunk 80 ml acetonban, majd acetonnal kiegészítjük 100 ml-re. Ezt követően a TPF standard oldatból 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ml-t pipettázunk 50 ml-es mérőlombikokba, hozzáadunk 8,3 ml Tris puffert, majd acetonnal kiegészítjük 50 ml-re. A kalibrációs sor optikai denzitását 546 nm-en mérjük, és elkészítjük a kalibrációs egyenest.

Mérés menete:

20–20 g nedves talajt és 10–10 ml TTC oldatot bemérünk egy-egy jól zárható 100 ml-es mérőedénybe, majd lezárás után 20 órán keresztül 25 °C-on rázatjuk 150 rpm-mel. A vak mintához csak 10–10 ml Tris-HCl puffert adunk, TTC helyett. Inkubáció után minden mintához 40 ml acetont adunk, ezután tovább rázatjuk 2 órán át. Az aceton kioldja a keletkezett TPF-t. 10 perc ülepedés után a talajszuszpenziót leszűrjük, és a szűrlet optikai denzitását 546 nm-en mérjük a vakra kalibrálva SANYO SP55 UV/VIS spektrofotométerrel.

Mérési eredmények értékelése és interpretációja

A kapott abszorbancia értékek ismeretében az előzőleg felvett kalibrációs egyenesről leolvassuk a TPF koncentrációkat, majd az alább megadott képlet segítségével egységnyi talajmennyiségre kiszámítjuk a dehidrogenáz aktivitást.

Dehidrogenáz enzimaktivitás = (μg TPF/ml*VA+TTC)/(szt*nt)

,ahol szt nedves talaj száraz tömege (g),  VA+TTC a hozzáadott aceton és TTC oldat térfogata (ml), és nt a felhasznált nedves talaj tömege (g).

Forrás: 

Alef, K. (1995) Estimation of microbial activities. Dehydrogenase activity, In: Alef, K & Nannipieri, P. (Eds) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press London, UK, pp. 228–231